Rodzice było ludźmi bardzo religijnymi.
Wiele lat później Jan wspominał ważne wydarzenie z lat dziecinnych. Kiedy będąc z matką w cerkwi dowiedział się, czym był ofiara krzyżowa Jezusa, zauważył spadającą z krzyża iskrę i za chwilę poczuł, jak ta iskra przeniknęła do jego serca. Od tego momentu ukochał liturgię. Przez kolejnych 20 lat nie opuścił żadnego nabożeństwa w cerkwi.
Początkowo uczęszczał do szkoły katedralnej w rodzinnym mieście, gdzie nauczył się czytania i pisania zarówno w języku staro-cerkiewno-słowiańskim, jak i w języku polskim. Później rodzice, którzy chcieli, by zajął się kupiectwem, wysłali go do Wilna, gdzie terminował u znajomego kupca Jacentego Popowicza. Tam zetknął się z unitami - katolikami obrządku wschodniego, którzy w Wilnie sprawowali liturgię w cerkwi Świętej Trójcy.
Na wschodnich rubieżach ówczesnej Polski, które były terenami granicznymi między prawosławiem na Wschodzie a katolicyzmem na Zachodzie, żyło wielu unitów. Kościół greckokatolicki sprawuje kult w rycie bizantyńskim, jednak w pełni w zgodzie z nauką Kościoła łacińskiego i podlega papieżowi. Od czasu schizmy w 1054 r. wielokrotnie zawierane były unie, dzięki którym część prawosławnych wracała do Kościoła katolickiego. Niestety, w tamtych czasach religia była bardzo związana z polityką, dlatego unie te nie były trwałe.
Na pograniczu Rzeczypospolitej i ziem ruskich już w 1257 r. dominikanie doprowadzili do pierwszej unii, która przetrwała do ujarzmienia Rusi przez najazd tatarski. Kolejne unie zawierane były w XV wieku. Największe znaczenie miała unia brzeska zawarta w roku 1596, czyli tuż przed przybyciem Jana do Wilna.
Młody Kościół unicki był bardzo atakowany przez prawosławie, popierane przez Kozaków i Moskwę. Dochodziło wielokrotnie do czynów zbrojnych. Unici byli traktowani jako odstępcy od wiary i zdrajcy. Wojsko atakowało unickie cerkwie, a hierarchowie usiłowali osadzać duchownych prawosławnych w ich parafiach. Doszło nawet do tego, że w roku 1620 przybył do Polski potajemnie jerozolimski patriarcha prawosławny Teofanes i na miejsce biskupów unickich konsekrował prawosławnych: we Włodzimierzu, Przemyślu, Pińsku, Łucku, Chełmie i w Połocku. W Kijowie osadził biskupa prawosławnego na miejsce unickiego metropolity. Ci właśnie biskupi wszelkimi środkami zmuszali unitów do powrotu do prawosławia.

W takim trudnym okresie Jan zbliżył się do grekokatolików. Zaprzyjaźnił się z Genadijem Chmielnickim, studentem Seminarium Papieskiego w Wilnie, z Piotrem Arkadiuszem, uczonym grekokatolickim, bardzo zasłużonym dla unii, oraz z Janem Welaminem Rutskim, który w Rzymie ukończył Kolegium Ruskie i przystąpił do unii. Zetknął się także z jezuitami. Dzięki tym kontaktom poszerzył swoją wiedzę i wzrastał duchowo.
W 1604 r. wstąpił do bazylianów (to jedyny w Polsce męski zakon obrządku greckokatolickiego) i złożył śluby w monasterze św. Jerzego. Od tego czasu nosił imię Jozafat. Aktu jego przyjęcia do zakonu dokonał sam metropolita unicki, Hipacy Pociej. Jako brat zakonny Jozafat kształcił się w niedawno założonej Akademii Wileńskiej, gdzie studiował filozofię, teologię, język starosłowiański i liturgię. W 1609 r. otrzymał święcenia kapłańskie i został magistrem nowicjatu. W roku 1613 powierzono mu funkcję przełożonego klasztoru i kościoła bazylianów w Wilnie, którą pełnił z wielkim zaangażowaniem. W latach 1614-1615 towarzyszył metropolicie halicko-kijowskiemu w podróży wizytacyjnej do Kijowa. Po drodze Jozafat zdołał pozyskać dla unii wojewodów połockiego i nowogrodzkiego oraz ufundować klasztor bazylianek w Krasnymborze.
W roku 1617 został mianowany arcybiskupem Połocka po zmarłym właśnie tamtejszym metropolicie. Święcenia biskupie otrzymał 12 listopada 1618 w Wilnie, po czym wyruszył do Połocka, by odbyć ingres. Zapisał się w pamięci współczesnych jako niezwykły arcybiskup, który nosił stale habit zakonny, nigdy nie jadał mięsa, mieszkał w jednej izbie, którą dzielił jeszcze z pewnym bezdomnym. Dla siebie niczego nie potrzebował, natomiast troszczył się o podwładnych i walczył o przywileje dla duchowieństwa unickiego. Dbał o splendor nabożeństw liturgicznych, niezmordowanie głosił słowo Boże, przemawiał do ludu przy każdej okazji. Szczególną zaś opieką otoczył chorych i ubogich. Był zwolennikiem wczesnej i częstej Komunii świętej. Często wizytował placówki i kapłanów. Dla duchowieństwa ogłosił konstytucje, składające się z 48 przepisów postępowania oraz dodatkowo z 9 paragrafów dla tych, którzy by łamali prawo. Dla mniej wykształconych kapłanów ułożył katechizm jako podstawę do nauczania. Wprowadził obowiązek odprawiania codziennie Świętej Liturgii. Od swoich kapłanów żądał odmawiania brewiarza i comiesięcznej spowiedzi. Wysyłał do nich pisma wyjaśniające różnice między katolicyzmem a prawosławiem.
Nie trudno się dziwić, że taka aktywność biskupa budziła niezadowolenie przeciwników unii z Kościołem rzymskim. Potężną kampanię przeciwko Jozafatowi wytoczył wspomniany już Teofanes, patriarcha Jerozolimy, który tajnie przybył jako delegat prawosławnego patriarchy Konstantynopola. Mianował biskupem prawosławnym Melecego Smotryckiego, który usiłował przekonać wiernych, że jest jedynym prawowitym biskupem na Białorusi. Pamiętać trzeba, że lud tych terenów był w większości niepiśmienny i z pewnością nie rozumiał sporów doktrynalnych. Prawosławni podgrzewali nastroje nacjonalistyczne i szkalowali abp Kuncewicza jako zdrajcę Cerkwi.
Kiedy Jozafat musiał w roku 1621 udać się na sejm do Warszawy, wroga mu kampania tak dalece się wzmogła, że zastał po powrocie wzburzone przeciwko sobie wszystkie miasta. W końcu uknuto spisek na jego życie. W październiku 1623 roku udał się do swojej sufraganii do Witebska. Rankiem 12 listopada, zaraz po odprawieniu Mszy świętej, został napadnięty i zabity. Rozjuszony tłum rzucił się na rabunek mieszkania biskupiego, a samego metropolitę maltretowano w sposób okrutny. W końcu dobito go strzałem w głowę. Przed śmiercią Jozafat Kuncewicz miał jeszcze powiedzieć: "Dzieci, czemu napadacie na mój dom? Jeśli macie coś przeciwko mnie, to mnie macie". Sponiewierane ciało Jozafata utopiono w Dźwinie.
Męczeństwo Jozafata poruszyło całą Polskę katolicką. Wielu katolików teraz dopiero zrozumiało, czym jest unia. Natychmiast też rozpoczęto proces kanoniczny. Jozafat został beatyfikowany przez papieża Urbana VIII w 1643 r., kanonizowany w 1867 r. przez Piusa IX. Jest patronem diecezji siedleckiej i drohiczyńskiej, zakonu bazylianów, Rusi, Litwy i Wilna.
Relikwie św. Jozafata przebyły prawdziwie tułaczą drogę. Były one składane w miastach Białorusi, na Litwie, w Polsce. W 1667 r. powróciły do Połocka, ale już w 1706 r. w obawie przed profanacją zostały umieszczone w Białej Podlaskiej. Po kanonizacji carat zażądał ukrycia relikwii. Zostały one przewiezione do Wiednia, a od 1949 r. spoczywają w bazylice św. Piotra w Watykanie. Relikwia lewej ręki św. Jozafata wraz ze skromnym pierścieniem biskupim znajduje się w bazylice Serca Jezusowego na Pradze w Warszawie. Z okazji 300-lecia męczeńskiej śmierci św. Jozafata w 1923 r. papież Pius XI wydał ku jego czci encyklikę Ecclesiam Dei admirabili.

W ikonografii św. Jozafat Kuncewicz przedstawiany jest w stroju biskupim rytu wschodniego. Jego atrybutem jest topór.